Η κήρυξη του πολέμου βρήκε τον Κωνσταντίνο Μητσοτάκη στην σχολή εφέδρων αξιωματικών Σύρου, απ' όπου και τοποθετήθηκε στη Μακεδονία, στο μετέπειτα γερμανικό μέτωπο. Μετά την κατάρρευση του μετώπου κατέβηκε στην Αθήνα και από εκεί μετέβη στην Κρήτη το 1942, όπου έλαβε μέρος στην αντίσταση κατά των Ναζί ως ηγετικό στέλεχος της Εθνικής Οργάνωσης Κρήτης (ΕΟΚ) και της Εθνικής Οργάνωσης Πληροφοριών και Δολιοφθοράς (ΕΟΠΔ) που αρχικά αποτέλεσε το στρατιωτικό σκέλος της Ανώτατης Επιτροπής Αγώνος Κρήτης (ΑΕΑΚ).


Ο Κωνσταντίνος Μητσοτάκης συνεργάστηκε στενά με τις συμμαχικές ομάδες (κυρίως βρετανικές), οι οποίες δρούσαν στο νησί κατά των Γερμανών. Για τη δράση του αυτή, φυλακίστηκε και καταδικάστηκε σε θάνατο δύο φορές από τους Γερμανούς. Τη πρώτη φορά πήρε χάρη με την ευκαιρία της εθνικής επετείου της 25 Μαρτίου 1944 και απελευθερώθηκε μαζί με άλλους εκατό περίπου συγκρατούμενούς του. Την 31η Μαρτίου 1945, αντηλλάγη για δεύτερη φορά, μαζί με 9 συντρόφους του, με τριπλάσιους γερμανούς αιχμαλώτους, λίγο πριν από την παράδοση των Γερμανών στα Χανιά. Η ανταλλαγή Ελλήνων πολιτών με Γερμανούς στρατιωτικούς, υπήρξε μοναδική στην ιστορία του Β' παγκοσμίου πολέμου και χρειάστηκε να εγκριθεί από την ανώτατη συμμαχική και γερμανική ηγεσία. Επίσης, στον Κωνσταντίνο Μητσοτάκη από την πλευρά των Ελλήνων και τον ταγματάρχη Denis Ciclitira από την πλευρά των Άγγλων, έγινε η μυστική παράδοση του τελευταίου Γερμανού Στρατηγού Benthag στο σπίτι του Ελευθερίου Βενιζέλου στα Χανιά, στις αρχές Μαΐου του 1945 προκειμένου να δρομολογηθεί η επίσημη παράδοση στο Ηράκλειο λίγους μήνες αργότερα. Ο Κ. Μητσοτάκης κατά την αποφυλάκισή του από τις φυλακές της Αγιάς, 25-3-1944

Ως στέλεχος της Εθνικής Αντίστασης, ο Κωνσταντίνος Μητσοτάκης ανέλαβε σημαντικές πολιτικές πρωτοβουλίες προς την κατεύθυνση της συνεννόησης των αντιστασιακών οργανώσεων, της Εθνικής Οργάνωσης Κρήτης (ΕΟΚ) και του Εθνικού Απελευθερωτικού Μετώπου (ΕΑΜ), για την αποφυγή του εμφυλίου πολέμου. Κάτι που τελικά επετεύχθη για το διάστημα εκείνο μόνο στην Κρήτη.

Για τον σκοπό αυτό, στις 7 Νοεμβρίου 1943 υπεγράφη στο Θέρισσο συμφωνία μεταξύ των αντιστασιακών οργανώσεων ΕΟΚ και ΕΑΜ, την οποία διαπραγματεύθηκαν και υπέγραψαν ο Κωνσταντίνος Μητσοτάκης από την πλευρά της ΕΟΚ και ο Μιλτιάδης Πορφυρογένης από την πλευρά του ΕΑΜ.Ο Κ. Μητσοτάκης με άλλα μέλη της Κρητικής Αντίστασης και Άγγλους αξιωματικούς στη Γεωργιούπολη μετά τη δεύτερη αποφυλάκισή του, Απρίλιος 1945
Ο Κ. Μητσοτάκης με άλλα μέλη της Κρητικής Αντίστασης και Άγγλους αξιωματικούς στη Γεωργιούπολη μετά τη δεύτερη αποφυλάκισή του, Απρίλιος 1945
Αξιοσημείωτο είναι δε, ότι το χειρόγραφο κείμενο της συμφωνίας του Θερίσσου είναι γραμμένο από τον ίδιο τον Κωνσταντίνο Μητσοτάκη. Η Συμφωνία του Θερίσσου, εκτός από την εδραίωση ενός κλίματος αμοιβαίας συνεννόησης και συνεργασίας μεταξύ των εν λόγω αντιστασιακών οργανώσεων και την αποφυγή του εμφύλιου πολέμου στην Κρήτη, συνέβαλε επίσης, στην από κοινού ανάληψη πολιτικών πρωτοβουλιών, όπως η κοινή προκήρυξη προς τον κρητικό λαό, που εξέδωσαν η ΕΟΚ και το ΕΑΜ τον Ιανουάριο 1944 και η υπογραφή νέας συμφωνίας συνεργασίας στις 2 Απριλίου 1944 κατά τις εργασίες του Α' Παγκρητικού Συνεδρίου. Η συμφωνία αυτή, συμπληρώθηκε με την συμφωνία της Τρομάρισσας, η οποία υπεγράφη την 15η Σεπτεμβρίου 1944 που συνέβαλε και εκείνη στην εμπέδωση ενός κλίματος αμοιβαίου σεβασμού και συνεργασίας ανάμεσα στις δύο οργανώσεις.

Στις 22 Νοεμβρίου 1945, ο Βρετανός Συνταγματάρχης Ντόλμπι, της Μονάδας 133 από το αρχηγείο της Μέσης Ανατολής, πρότεινε την παρασημοφόρηση του Κωνσταντίνου Μητσοτάκη από τις Βρετανικές Αρχές για διακεκριμένες υπηρεσίες καθώς και την απονομή σ' αυτόν, παράσημου ανδρείας. Για τους ίδιους λόγους έχει τιμηθεί και από τις Ελληνικές Αρχές.
πηγή ϊδρυμα Κωνσταντίνος Μητσοτάκης